对虾白斑综合征病毒亚单位疫苗研究进展
摘 要：对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是一种可以引起养殖对虾暴发性死亡的传染性病原，由于其强烈的传染性和极高的致死率，使得人们在应对它时，必须侧重于早期的防控。近年的研究表明，对虾存在类免疫(quasi-immune)机制，而WSSV 的重组蛋白可以诱导对虾产生抗病保护效应。目前有关对虾白斑综合征病毒亚单位疫苗的研究大多围绕诱导产生高效免疫应答能力的囊膜蛋白进行免疫接种方式来展开。文章对该领域研究成果做一综述，旨在为今后WSSV 的防控提供参考。
关键词：对虾白斑综合症病毒；囊膜蛋白；亚单位疫苗
对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)具有致病性强、危害性大、地域分布和宿主范围广泛的特点。1992首先在台湾暴发，然后迅速蔓延到东南亚一带国家，最后到北美，对养殖业造成巨大的损失，同时也给海洋生态平衡带来了一定的威胁，从而使各国研究机构掀起了对该病毒的研究热潮。目前研究可以确认在涉及到的甲壳类动物中，对虾对该病毒的抵抗力最弱，而且WSSV有很多的传染途径，感染3d～10d内累计死亡率可以达到100％，造成高死亡率的暴发性病毒病。
WSSV是新设立的Nimaviridae科Whispovirus属的代表种，目前人们对其致病机理知之甚少，还不能有效地控制疫情。通常认为，对虾等无脊椎动物没有类似于脊椎动物的适应性免疫系统，应用疫苗免疫还存在着很大的争议，对虾疫苗的研究除弧菌疫苗外几乎没有其他成功的疫苗。随着WSSV全基因组序列测序的完成，对病毒结构蛋白性质与功能的深入研究具有非常重要的意义。尤其对诱导产生高效免疫应答能力的囊膜蛋白进行鉴定、克隆与表达，为最终揭示其发病和免疫的分子机理和亚单位疫苗的研制和开展，提供了坚实的基础。
1 对虾白斑综合征病毒结构蛋白
病毒蛋白是病毒最主要的组成成分，其中囊膜蛋白在病毒的感染和装配过程中起着重要的作用。由于WSSV蛋白结构复杂、成分多样、信息量大，为分析和定位蛋白结构的多肽组成带来一定的难度。WSSV 的主要结构蛋白有5个，即囊膜蛋白VP28、VP19、VP26／P22及核衣壳蛋白VP15、VP24。VP28由ORF1所编码，其N端有一高度疏水的A2螺旋跨膜区域，是位于病毒囊膜的主要抗原蛋白。基因组上编码VP19 的为ORF182，VP19的氨基酸序列上有两个跨膜区域，使其固定于病毒囊膜上。位于ORFI53上曾被认为是核衣壳蛋白基因的VP26基因，用免疫胶体金技术在透射电镜(TEM)下观察到胶体金颗粒位于病毒粒子的囊膜部位，从而确定VP26／P22为囊膜蛋白。VP15基因位于病毒基因组ORF109，其编码的蛋白是与核衣壳相连的基本DNA 结合蛋白。VP24是ORF31编码的，它也是位于核衣壳上的DNA结合蛋白。以上5个主要的结构蛋白均无糖基化位点，而具有囊膜结构的病毒的某些蛋白常以糖蛋白形式出现，因此推测WSSV囊膜上存在的次要结构蛋白中可能有糖基化位点。WSSV 的次要结构蛋白已发现有VP281、VP35和VP466，除VP35为核衣壳蛋白外，其余两个均为囊膜蛋白。VP281由ORF1050编码，VP281中存在一细胞黏附序列(RGD三肽序列)，提示此囊膜蛋白可能在介导WSSV感染时发挥重要作用；另一次要囊膜蛋白VP466中第338个～358个氨基酸残基构成的α螺旋跨膜区域，可能在介导VP466进入核内进行病毒囊膜装配过程中发挥一定的作用。目前对虾白斑综合征病毒亚单位疫苗的研究大多围绕诱导上述一些能够产生高效免疫应答能力的囊膜蛋白进行表达并进行免疫来展开。
2 对虾白斑综合征病毒亚单位疫苗
针对对虾白斑综合征病毒的传统预防及治疗性疫苗，包括灭活疫苗和减毒活疫苗，可是都存在不少缺陷，如灭活疫苗被评价认为：①用强毒株生产安全性差，需严格控制管理生产条件；②保护期短，需每年加强注射；③ 副反应率高；④ 疫苗价格昂贵，而且对对虾白斑综合征病毒保护效果不佳等。而减毒活疫苗在减毒过程中必然会失去某些毒力因子，而使疫苗株的抗原性不够完全，对对虾白斑综合征病毒均不能完全保护。总体上说，利用基因工程技术生产对虾白斑综合征病毒新疫苗才是今后的研究方向。利用基因工程技术所生产的疫苗包括亚单位疫苗、肽疫苗、DNA疫苗、活体重组疫苗等，在对对虾白斑综合征病毒的基因防控中，研究成果最为丰富的当属亚单位疫苗。虽然对虾等无脊椎动物没有类似于脊椎动物的适应性免疫系统，应用疫苗还存在着很大的争议。但研究发现，WSSV的重组蛋白可以诱导对虾产生抗病保护效应。
2．1 针对VP28囊膜蛋白抗原的亚单位疫苗
迄今已确定编码结构蛋白的WSSV 基因有4O余个。其中VP28是病毒的主要囊膜蛋白之一，在病毒感染机体的早期可能起关键作用，国内外的研究将其作为设计免疫预防性药物的靶位点。目前，VP28基因已在原核或真核生物表达系统内表达，并且发现表达产物具有显著的抗病毒保护效应，而且比其他的囊膜蛋白有着更好的保护效应，所以以VP28作为免疫的亚单位疫苗优势明显 。
Witteveldt J等首先用pET28原核表达载体表达VP28蛋白用于制备亚单位疫苗，效果很好，在对对虾免疫接种20d后的第3天和第7天测定对虾的相对存活率较高，分别为64％和77％，在第21天测定相对存活率为21％，结果显示亚单位疫苗虽然有较好的保护效率，但是作用时间不是很长，需要经常免疫来增强效果，这是首例在预防WSSV上应用到的亚单位疫苗，为后来研制防治WSSV起到了带动和启发的作用。Witteveldt J在最后得出“如果疫苗中没有VP28预防作用会很小”，不过这一结论在以后的研究中很快的被推翻了。接下来，Fu L L等用另一种原核表达载体pBS-H1在孢子和植被细胞中表达来制备，在孢子表达的免疫效果显著高于植被细胞。经过2Od免疫后在第3天，第7天和第18天分别测定对虾的累计死亡率分别约为91.7％和85.0％、83.3％和100％、88.3％和95％，在第14天免疫效果最显著，累计存活率分别为51.7％和78.3％，结果显示对WSSV的预防效率依然很高，直接证实了Witteveldt J等在先前的研究。而魏克强等将含有WSSV囊膜蛋白VP28基因的重组杆状病毒HyNPV-VP28 感染家蚕(Bombyxmori)蛹，免疫35d后进行口服攻毒，20d内rVP28疫苗组的累积存活率为63.33％，与阳性和阴性对照比差异显著(P<0.05)，PRP分别达54.16％和59.26％；注射攻毒后2Od内rVP28疫苗组的累积存活率与阳性和阴性对照组比差异不显著(P>0.05)，PRP分别为46.12％和49.99％。第55天对存活虾再口服接种攻毒，20d内rVP28疫苗组与阳性和阴性对照组比累积存活率差异显著(P<O.05)，PRP分别为55.80％和63.16％；二次注射攻毒后，rVP28疫苗组的PRP均为31.25％。对rVP28疫苗组存活虾的胃、肠和肝胰腺组织进行病毒的原位杂交检测均呈阴性反应，而对照组死亡虾组织都呈阳性反应。这些结果进一步证实了VP28可以作为亚单位疫苗预防WSSV。
2．2 针对VP19囊膜蛋白抗原的亚单位疫苗
VP19是病毒的另外一个主要的囊膜蛋白，VP19在囊膜蛋白的成分中所占含量仅次于VP28，可见其作用也很关键，国内外的研究将其作为设计免疫预防性药物的靶位点。目前，VP19基因已在原核或真核生物表达系统内表达，并且发现表达产物具有显著的抗病毒保护效应，保护效应次于VP28囊膜蛋白。
贾启军等用pET32表达载体表达融合蛋白Trx-VP19，注射纯化Trx-VP19蛋白组的螯虾8d后累计死亡率为50％，注射纯化Trx蛋白组的螯虾8d后积累死亡率为95％，说明注射重组蛋白Trx-VP19可以明显的提高抗WSSV 的感染力，而投喂试验显示没有明显的差异。阳性对照组的螯虾在感染WSSV 9d后累计死亡率达到100％，并在3d～5d达到死亡高峰，而注射了TN buffer的阴性对照组螯虾无任何病理现象。由此试验证实了VP19也可以作为亚单位疫苗应用于预防WSSV。间接否定了Witteveldt J等 “如果疫苗中没有VP28预防作用会很小”这一结论。
2．3 针对VP28囊膜蛋白抗原与VP19囊膜蛋白抗原组成双价抗原的亚单位疫苗
针对VP28和VP19的各自的亚单位疫苗对自斑综合征病毒都很有效这一结论，进一步研制VP28囊膜蛋白抗原与VP19囊膜蛋白抗原组成双价抗原的亚单位疫苗，结果证实双价抗原的亚单位疫苗对白斑综合征病毒有更好的预防作用。
魏克强等以重组杆状病毒HyNPV-VP28和HyNPV-VP19感染的家蚕蛹研制成白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白rVp28和rVP19亚单位疫苗，并对克氏原螯虾持续口服免疫接种75d，观察其对WSSV的抗病保护能力。免疫接种35d后进行口服攻毒，rVP28、rVP28+rVP19疫苗组的累积死亡率与对照组比较差异显著(P<O.05)，免疫保护率(RPS)均达59.26％；注射攻毒后，rVP28疫苗组的累积死亡率比阳性对照组降低4O％。第2次口服攻毒，rVP28、rVP28+rVP19疫苗组呈更显著的保护作用，RPS分别达到63.16％、68.42％；第2次注射攻毒，各疫苗组的累积死亡率比对照组降低3O％。魏克强等制备的rVP19和rVP28抗血清也在不同程度上抑制WSSV 的感染。Rajeev K J等也在最近更加深人的研究得到VP28和VP19囊膜蛋白不同的方式，结果显示无论那种方式得到的蛋白组合都可以有效地抑制WSSV的侵染。
2．4 针对其他结构蛋白抗原的亚单位疫苗
鉴于VP28和VP19对白斑综合征均有很好的预防效果，有些研究人员着手研究其他的一些结构蛋白是否也可以对白斑综合征病毒产生免疫的效果。而结果也证实了当初的设想，已经证实的如VP187和VP292都可以有效地抑制白斑综合征病毒的感染。
Li D F等表达了VP187作为亚单位疫苗应用于试验，结果显示VP187可以作为亚单位疫苗应用于WSSV 的预防。Vaseeharan B T也表达了VP292作为亚单位疫苗预防WSSV，试验结果显示在30d内，通过注射的方法免疫接种，累计存活率可以达到52％，这也证实了其他的一些结构蛋白可以应用于WSSV 的预防。
2．5 针对其他结构蛋白组成的双价或多价抗原的亚单位疫苗
鉴于对VP28囊膜蛋白等亚单位疫苗的研究，有学者研究了其他各种结构蛋白组成的亚单位疫苗在对防治白斑综合征病毒产生免疫的效果，结果发现很多双价或多价抗原的亚单位疫苗在预防中起到很显著的效果。
“ L J等串联表达了VP36A，VP36B和VP31用于试验，结果显示，在体内试验中，这些蛋白并未表现出很好的效果，累积死亡率依然很高。但在体外中和试验中，VP36B和VP31都有很强的抑制WSSV的作用，具体原因还在研究当中。Namikoshi A等分别表达rVP26和rVP28作为亚单位疫苗应用于试验，结果显示rVP26也对WSSV有抑制作用，累计存活率可以达到56％，rVP28一起应用时，能够达到95％，可以作为亚单位疫苗应用于预防WSSV的侵染。
3 结语
由于WSSV具有广泛的宿主范围，在甲壳纲和昆虫纲动物中均有其敏感的宿主，以虾、蟹等十足目类为多。目前，普遍认为WSSV存在水平传播(经口感染或浸泡感染)及垂直传播两种传播途径，可独立在动物中流行，因此难于在短期内彻底消除。而WSSV为暴发性传染病。该病感染率和死亡率都极高，所以研究针对WSSV的全新预防用的安全有效疫苗，实属当务之急。基因工程疫苗技术是一项新兴的具有应用前景的生物技术，在我国生物技术的发展虽然面临许多问题，但从长远来看前途还是光明的。研制WSSV疫苗的首要原则就是要获得巨大的经济效益和社会效益，并且研究人员利用现代最先进的分子生物学技术，构建基因重组WSSV亚单位疫苗已经取得了可喜的进展，虽然大部分还处在试验阶段，相信实际应用于临床已为期不远。
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