利用复合微生物降解养殖水体中亚硝酸盐的初步研究
作者：天津市农业生物技术研究中心 张峰峰 谢凤行 周可 赵玉洁 李亚玲
摘 要：在养殖水体中对保存的芽孢杆菌、反硝化细菌、乳酸菌降解亚硝酸盐的能力进行比较，发现3种菌株对亚硝酸盐均能较好地降解，但降解速度不同，反硝化细菌＞乳酸菌＞芽孢杆菌；对3种菌株混合接种发现，具有较好净化水质效果的最佳接菌配比为芽孢杆菌∶反硝化细菌∶乳酸菌＝1∶1∶2，在30℃、接种量为1％的条件下，以该配比接种亚硝酸盐，硝酸盐初始质量浓度分别为12．85、54．42mg／L的模拟养殖水体中，其亚硝酸盐、硝酸盐降解率在24H内均超99．99％，水体中的PH 值显著降低，水体中的氨氮变化较小，可以实现对养殖水体的快速脱氮。
关键词：反硝化细菌；乳酸菌；芽孢杆菌；亚硝酸盐
在水产养殖过程中，随着人工配合饵料的投喂以及鱼、虾代谢产物的积累，常导致氮在养殖水体中的大量积累，而不同形态的氮又可通过微生物的作用转化成亚硝酸盐。亚硝酸盐通过鱼类呼吸作用由鳃部进入血液，与血红蛋白发生氧化还原反应生成无携氧能力的高铁血红蛋白，造成血红蛋白活性下降或功能性贫血症，导致生理性缺氧，甚至死亡，降低了养殖水产品的产量。因此，控制养殖水体中亚硝酸盐浓度一直是水产养殖工作者研究和探索的问题。
近年来，应用生物处理的方法控制水体中亚硝酸盐取得了一定的成效。前人的研究表明，有多个种类的菌株具有降解亚硝酸盐的功能，如光合细菌，硝化细菌，假丝酵母，巨大芽孢杆菌，短乳杆菌，也有研究对多个菌株进行复合接种，但由于作用时间较长，降解条件苛刻，降解效率较低，未能达到实际生产中高效快速的降解要求。
笔者利用解淀粉芽孢杆菌、反硝化细菌、乳酸菌对养殖水体中亚硝酸盐降解能力进行对比试验，试验结果进行最适配比复合接种，筛选出一种复合微生态制剂，以达到快速降解水体中亚硝酸盐、硝酸盐，改善水质，减少或预防养殖病害发生，提高产量和取得最佳经济效益的目的。
1 材料与方法
1．1 菌种和培养基
芽孢杆菌经16S RDNA 测序鉴定为解淀粉芽孢杆菌，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏号CGMCC NO．3261）；反硝化细菌在池塘中分离，初步鉴定为假单胞菌属的一种；乳酸菌为本实验室秸秆发酵剂中分离提取，经常年使用，无毒无害，属乳杆菌属的一种。全部经由天津市农业生物技术研究中心微生物实验室分离保藏。
芽孢杆菌用牛肉膏蛋白胨培养基；反硝化细菌用DM 培养基；乳酸菌用MRS培养基。
1．2 培养方法
将芽孢杆菌、反硝化细菌、乳酸菌分别接种于相应的固体培养基平板上，分别于37、30、25℃下恒温培养24～48h，活化后，分别接种于对应的液体培养基，再于37、30、25℃恒温摇床上扩大培养24～48h，菌液密度为30×108cfu／ml。
1．3 水样的预处理
试验水样取自天津市西青区水产养殖池，放置2ｄ，使水样杂质沉淀后，取上清液备用，其初始亚硝酸盐质量浓度为0.021mg／l。
1．4 单株菌降解亚硝酸盐能力测定
1．4．1 芽杆菌降解能力的测定
将玻璃容器中装3L模拟养殖废水，加入适量亚硝酸钠，使水样中亚硝态氮的初始质量浓度为13mg／L，接入30 ml芽孢杆菌菌液经7500R／min离心10min后的菌泥，使水体中的菌的密度达3×107cfu／ml，以不加菌为对照，每个处理3个重复，置于37℃培养箱中培养，每日定时取样测定水中亚硝酸盐的含量。
1．4．2 反硝化细菌降解能力的测定
将玻璃容器中装3L模拟养殖废水，加入适量亚硝酸钠，使水样中亚硝态氮的初始质量浓度为35mg／L，接入30ml反硝化细菌菌液，使水样中菌的密度达3×107cfu／ml，以不加菌为对照，每个处理3个重复，置于30℃培养箱中培养，每日定时取样测定水中亚硝酸盐的含量。
1．4．3 乳酸菌降解能力的测定
将玻璃容器中装3L模拟养殖废水，加入适量亚硝酸钠，使水样中亚硝态氮的初始质量浓度为12mg／L，接入30ml乳酸菌菌液经7500R／min离心10min后的菌泥，使水样中菌的密度达3×107cfu／ml，以不加菌为对照，每个处理3个重复，置于25℃培养箱中培养，每日定时取样测定水中亚硝酸盐的含量。
1．5 菌株复合接种的试验方法
在玻璃容器中装3L模拟养殖废水，调整亚硝态氮的初始质量浓度为12mg／l，芽孢杆菌和乳酸菌经7500R／min离心10min后去上清液，将菌泥加入水样中，反硝化细菌直接投加菌液，使水样中菌的密度均达到3×107cfu／ml，以不加菌为对照组，共11个处理，每个处理3个重复。接菌后测定亚硝酸盐、硝酸盐、氨氮、PH 等水质指标的初始值，白天用白炽灯增加光照7～8H，以保证温度达30℃。投菌比例见表1。
1．6 水质测定方法
亚硝酸盐采用N－（1－萘基）－乙二胺光度法测定；氨氮采用纳氏试剂比色法测定；硝酸盐采用酚二磺酸光度法测定；PH 用METTLER S20酸度计测定。
1．7 分析方法
采用统计软件SPSS 15.0进行单因素方差分析。
2 结果与分析
2．1 单株菌对亚硝酸盐的降解效果
与对照组相比，芽孢杆菌可显著降低水体中的亚硝酸盐（图1）。经120h，芽孢杆菌将亚硝酸盐由12．86mg／L降至0．65mg／L，降解率达94．8％，降解速度为0．098mg／（L·h）。经40H，反硝化细菌将亚硝酸盐由32．86mg／L降至0．0021mg／L，降解率达99．99％，基本被完全降解，降解速度为0．821mg／（L·h）（图2）。经48h，乳酸菌将亚硝酸盐由12．36mg／L降至0．016mg／L，降解率达99．87％，降解速度为0．257mg／（L·h）（图3）。对比3种菌株对亚硝酸盐的降解效果，发现3株菌在单独接种的情况下，均能通过一定的时间基本彻底地降解模拟水体中的亚硝酸盐，但其降解速度有一定差异，反硝化细菌＞乳酸菌＞芽孢杆菌，说明3株菌对亚硝酸盐均能较为彻底的降解，但3株菌对亚硝酸盐的降解均未能在24h内完成，降解效率较低，因此，对3株菌进行进一步不同配比的复合接菌，以期复配出能高效快速降解亚硝酸盐的复合菌剂。
2．2 复合菌株接种的水质净化效果
不同接菌处理的亚硝酸盐含量均低于对照（图4），随着时间的增加，各个接菌处理的亚硝酸盐均为逐渐降低的趋势，但各处理存在一定差异。单株接菌的3个处理（处理1，2，3）与2株混合接菌的3个处理（处理4，5，6）在24h的降解率均低于3株菌的混合接菌处理（处理7，8，9，10）。比较单株接菌的3个处理24h亚硝酸盐降解率，芽孢杆菌＜反硝化细菌＜乳酸菌。比较两株混合接菌的3个处理24H亚硝酸盐降解率，芽孢杆菌＋乳酸菌＜芽孢杆菌＋反硝化细菌＜反硝化细菌＋乳酸菌。而3种菌株
的混合接菌处理（处理7，8，9，10）降解速度均较快，在24h 内对亚硝酸盐的降解率达到99．99％，但不同比例接菌的4个处理之间24h的降解率并无显著差异（P＞0．05），说明3种菌株的混合接菌处理均能较快的降解水体中的亚硝酸盐，降解效率较高。
不同接菌处理在降解水体中亚硝酸盐的同时，还对硝酸盐有一定的降解作用（图5）。由图4、图5对比可知，各个处理的菌株对硝酸盐的降解和对亚硝酸盐的功能相似，降解趋势相同。且均呈现3种菌株的混合接种优于单株接种和2种菌株接种的处理，且3种菌株的混合接种之间亦无显著差异（P＞0．05）。据此可知，3种菌株的混合接种降解亚硝酸盐和硝酸盐的能力均较强。
不同接菌处理的氨氮在接种后24h存在升高的趋势（图6），但随后48h又逐渐降低，接菌后72h基本趋于平稳。可能在接种后，菌体的加入和繁殖，短时间内增加了水体中的氨氮含量，但随着菌体消耗，又使水体中的氨氮趋于稳定。氨氮质量浓度的变化低于0．6mg／L。菌体的加入，对水体中的氨氮影响较小。
各个处理的PH 值为8．2～8．8，对照组的PH值呈逐步上升趋势，且均高于其他接菌处理组，而接菌处理的PH 值有一个明显的下降趋势，随后又有所上升，对72h的PH 值进行方差分析表明，接菌处理的PH 值均显著低于对照组（P＜0．05），这进一步证明了接菌处理可明显降低水体的PH 值。
尤其是接种乳酸菌较多的几个处理（处理3，5，6，10）PH 值均显著低于其他处理组，说明乳酸菌由于发酵产酸，具有很好的降低PH 值的作用（图7）。
3 讨论
亚硝酸盐的存在，是当前水产养殖和水环境治理过程中面临的较大问题，目前最为有效、应用最为广泛的是微生物去除的工艺方法。已有研究表明，解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌同源性较强，它能促进动物对营养物质的吸收，增强机体免疫功能，促进动物生长；反硝化细菌为好氧的化能自养型细菌，可以将水体中的硝酸盐、亚硝酸盐转化为N2，达到彻底的脱氮；乳酸菌是胃肠道中正常存在的优势菌群，在促进水产养殖动物生长、抑制病原菌、防治疾病发生、提高苗种的成活率等方面均有积极的作用。
本研究根据3种微生物本身的特性，分别研究了解淀粉芽孢杆菌、反硝化细菌、乳酸菌对亚硝酸盐的脱氮作用，发现3种菌对亚硝酸盐的去除效果较好。将3种菌株按一定配比组合，研究其对模拟养殖水体的水质影响。试验结果发现，对于降解水体中的亚硝酸盐和硝酸盐2种含氮化合物，3种菌株的混合接种显著优于单株接种和两株接种的处理，其降解率在24h之内均超过了99.99％，由此可见，这3种菌株之间的协同作用对亚硝酸盐和硝酸盐的降解效果更显著、快速。推测其原因，可能是生物特性的互补：反硝化细菌通过还原酶作用直接将水体中的无机氮氧化合物转化为氮气，而乳酸菌、解淀粉芽孢杆菌为异养型细菌，能分解利用有机含氮物质，为反硝化细菌的生长创造条件，促进硝酸盐、亚硝酸盐的降解；乳酸菌在厌氧或兼性厌氧条件下生长，反硝化细菌、芽孢杆菌在有氧条件下生长，好氧菌的生长为厌氧菌生长创造条件，同时确保在有氧、无氧条件下亚硝酸盐的降解。
施大林等利用光合细菌、乳酸菌、纳豆芽孢杆菌、硝化细菌进行复合配比净化养殖水体，在氨氮、亚硝酸盐起始质量浓度分别为1.2、0.25mg／L的情况下，其最优净化效果为：复合接菌处理5ｄ，氨氮的去除率达80％；处理3ｄ，亚硝酸盐的去除率接近100％。比较而言，本研究中氨氮含量变化不大，但复合微生物对硝酸盐，亚硝酸盐的降解速度均较快。此外，本研究中接种乳酸菌有利于降低水体中的PH 值。不同配比的3种菌株的混合接种处理之间的水质并无显著区别，但考虑降低PH 值的需要，选择比例为芽孢杆菌∶反硝化细菌∶乳酸菌为1∶1∶2。由于此研究仅限于室内模拟养殖水体的结果，在以后的工作中尚需进一步的大型试验证明。
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