鱼类气泡病引起的内皮损伤
D.J. Speare，加拿大，1991年
摘要：
本实验用的两组健康大马哈鱼均饲养在曝气水体中，在实验中发现了肉眼可见的气泡病病变，并且使用光学及扫描电镜观察血管内的病变。气泡进入血管后，血管严重扩张，并且气泡周围的内皮组织发生了细胞脱落现象。在这些已知的结果上，讨论了鱼体气泡病的病变与人体气泡病的相同点，特别是都出现了止血功能障碍。
引言：
气泡病是导致水生动物发病以及死亡的常见因素 (Weitkamp and Katz, 1980），这与长期接触饱和气体相关(D'Aoust and Smith, 1974)，最新的研究(Machado, Garling, Kevern,Trapp and Bell, 1987; Smith, 1988; Speare, 1991) 重新定义了之前的关于气泡病在鱼体形态学的病变。鱼类的气泡病，尤其是鲑鳟鱼类的气泡病被作为是人体气泡病研究的一个模型在做相关的研究(D'Aoust andSmith, 1974)，包括血管内的栓塞以及血栓细胞的病变。包括气泡病的形成都有相关的研究(Levin et al., 1981; Tanoue el al., 1987; Francis,Pezeshkpour and Dutka, 1989)。还有气泡病的病理过程都有过相关的研究(Smith, 1988; Speare, 1991)。
内皮损伤是触发血管血栓的重要原因，但气泡病是否在此过程中形成还不得而知。因此在人体以及鱼体发病模型中，有关血栓形成的机理还是未知。通过在鱼体得气泡病期间，检查血管内的气泡，对鱼体气泡病内的引起的内皮损伤进行了研究。
实验方法和步骤
如何进行气体过饱和诱导
本次实验用的75尾健康大马哈鱼，饲养在500L的玻璃缸内。养殖大马哈鱼的实验用水都是抽取的地下水，并且将过多的氮气排掉。做气体饱和处理之前的两天，分别从两组实验鱼中挑出6尾鱼，接下来的处理将在下面的提到。将剩余的鱼做过饱和气体诱导，将过饱和气体直接排到水箱中。并且对玻璃缸的水进行搅拌，使水中的气体含量达到一个最佳的亚致死的饱和状态。实验持续两周，期间控制气体的饱和量基于鱼体得一个高的发病率，但不致死。鱼体皮内存在气泡以及眼球突出，被认为是进行了气体过饱和处理。
水体气体饱和度
水体的气体饱和度从水体中的气体压力中计算得到(Bouck, 1980)，通过外斯饱和器测量水体气体压力(Eco Enterprises, Seattle, Washington)。机械搅拌水体会使水体气体饱和度维持在在110%-124%的饱和度之间。
组织病理切片及扫描结构
经过2个星期的气体过饱和诱导之后，分别从两个缸中取出的6尾鱼，总共12尾鱼用来做病理学切片。这十二尾鱼是在气泡饱和处理过程中，出现从肉眼可以看见鳍条、眼眶周围、嘴巴顶部出现气泡而被挑出。实验鱼被致死后，没有进行任何处理，以防鱼体一些组织病理学的变化。
用过量的甲磺酸将样品鱼单独致死，取出心脏，做横切面切片，口腔顶部解剖，横切纵切。心脏，口腔，表皮用波恩氏液固定，以及用2.5%的戊二醛溶液溶解在0.1M的磷酸缓冲溶液中，用来做扫描电镜。
组织块处理进行普通的组织学观察处理。石蜡切片采用苏木精-伊红染色。做扫描电镜的组织块固定在四氧化锇溶解在2%的磷酸缓冲液中，用高浓度的酒精脱水，……为了避免人为因素而使内皮外观的造成变化，对照组与暴露组都采用相同的处理。
实验结果
如图1所示，对照组的心脏细胞及血管内皮细胞呈五边形或者六边形，细胞表面凹凸不平，细胞之间有许多沟回。
诱导组的鱼体表面有许多不同大小的半透明的气泡。在图2中可以看到，在口腔周围典型的气泡直径大于4mm，分别用光学显微镜和扫面电镜观察，结果显示这些气泡分别位于真皮以及皮下组织，以及在血管内壁（图3）跟血管外壁（图4）。
血管因一些大的血管气泡而扭曲变形（图3），这些气泡的外壁也相应鼓起，并且外壁似乎比周围的稍薄（图3），并可能引起周围组织发生同样的病变（图5）。
将对照组的鱼与诱导组的鱼的血管做比较发现，因为血管变形，内皮细胞层发生了一些变化。简单来说，出现了囊泡以及细胞膜顶端有色素点沉着。细胞变肿大，以及细胞间隔不太明显，出现了融合。从图7、图8可以看到诱导组内部的结缔组织形态，有些区域被一些小的圆形细胞充满。
从图4、图9可以看到诱导组血管内、外的气泡导致了炎症反应。缩小变形结缔组织旁边的大泡伴随着水肿和大量疏松的纤维蛋白。此外，一些嗜中性粒细胞周围也发现了一些气泡。
讨论
在潜水病中凝血机制被激活(Levin el al., 1981; Tanoue et al., 1987)，相似的，一个类似于弥散性血管内凝血的凝血功能紊乱在鲑鳟鱼类气泡病中有发现(Casillas, Miller, Smith and D'Aoust, 1975)。在潜水病中，细胞中的微血栓受单一或者多个因素的影响。这些因素包括气体对内皮层（在动脉与静脉里的单细胞层）以及血小板的影响，这两种受损细胞的间接影响(Warren el al., 1973; Levin el al., 1981; Tanoue el al., 1987)，近来的研究表明，气泡病也可以造成内皮损伤，这可能是促使鱼体止血功能紊乱的原因Casillas et al. (1975) and Speare (1991)。众所周知，完整的内皮细胞是抑制血栓的形成关键步骤。并且，大范围的组织损伤，尤其是大片内皮细胞层的损伤，可以通过激活凝血级联的直接影响或者内皮下的胶原蛋白的间接影响导致弥散性血管内凝血。潜水病中的内皮损伤表现在全身性的组织损伤以及炎症反应(Levin et al.,1981; Catron, Flynn, Yaffe, Bradley, Thomas, Hinman, Survanshi, Johnson,and Harrington, 1984)。换句话说，两者之间的作用是必然联系(Warren et al., 1973)。近来的研究发现，结构性的内皮病变显然受限于一些大气体栓子。这表明气泡病中气体是直接或间接引起内皮病变的因素。这个结论可以通过气体栓塞实验证明，通过血管内气泡产生的压力可以直接引起内皮损伤(Warren el al., 1973; Mason and Balls, 1980)。研究发现，血管内气泡越大，引起的内皮损伤也越严重。从基因位点数据来看，在气泡病诱导过程中，气泡是一直增多的。气泡增长的机制在潜水病的研究中也有提到(Strauss, 1979)。
一些行为可以间接引起气泡的产生，同时可能也是导致内皮损伤的介质。在潜水病的研究表明，内皮细胞中的白细胞与血小板因素可以导致内皮损伤(Flick, Perel and Staub, 1981; Levin et al., 1981)。另外，内皮损伤往往导致白细胞数量的变化(Stewart, Ritchie and Lynch, 1974)。在本研究中发现，血管周围细胞的炎症反应证明了在气泡病血管发生内皮损伤可能。
另一方面，在内皮中气泡的间接影响是明确了的。一些大的气泡可以完全抑制血液流动。内皮损伤所导致的缺氧损伤，通常发生在地下水过饱和的氮气而引起的气泡病(Weitkamp and Katz, 1980)。并且，我们研究发现内皮细胞层损伤的形态以及变化，通过内皮细胞缺氧实验by Mason and Balls（1980）多次证明观察到。但是，由于各种刺激对内皮损伤的范围研究还比较有限(Masonand Balls, 1980)，所以本研究中内皮细胞损伤的机制还没有定论。
小结：本研究提供鲑鳟鱼鱼类发生气泡病，血管栓塞时可以造成内皮细胞层损伤的形态学依据。接下来的研究非常有意义，将围绕气泡病病理学机制以及潜水病对人体的影响。
利洋 邓美英翻译 陈明卫校
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